在之前发布的文章中，我们详细介绍了慢病毒如何将外源基因有效地整合到宿主染色体中，从而实现长期在体内表达的特性。慢病毒的广泛感染能力使其成为基因传递的优选工具，适用于几乎所有哺乳动物细胞、干细胞及原代细胞。然而，获得包装好的慢病毒后，后续的操作步骤该如何进行呢？今天，尊龙凯时将为大家详细解析获取慢病毒后的操作流程，内容干货满满，请继续阅读！

1. 病毒的储存

建议将分装好的慢病毒置于-80℃的冰箱中保存，储存期限一般为半年。如超过半年，使用前需重新测定病毒滴度。若短时间内（3-5天）进行实验，亦可将其置于4℃保存。此外，在使用过程中应尽量避免反复冻融，因为冻融会导致病毒滴度下降，建议根据实际实验量进行分装。

2. 病毒的稀释

如需对病毒进行稀释，可先将其在冰浴中融化，然后用PBS或不含血清的培养基进行稀释，混匀后在4℃保存。为确保病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

3. 确定最佳的MOI值

不同细胞对慢病毒的敏感性不同，因此需要通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（MOI）及最佳的感染条件。实验步骤如下：

第1天：将生长状态良好的目标细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放置于37℃、5% CO₂培养箱中过夜。以第2天细胞密度30-50%为宜。

第2天：根据实验需要或参考文献的MOI值设置梯度范围（一般为3-100）。将-80℃冰箱取出的病毒在冰浴中融化，并计算所需的病毒液体积。

第3天：更换培养液，通常在病毒感染16-24小时后更换为正常培养液，继续培养。

第4-5天：使用荧光显微镜观察感染48-72小时后的荧光情况，估计感染效率，并确定适合用于正式实验的MOI值。

4. 正式感染实验

当确定了MOI值后，即可进行正式感染实验。以24孔板中使用带有GFP标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，具体步骤如下：

第1天：根据实验需求将细胞铺板，细胞密度约为5-10×10⁴cells/孔，37℃培养过夜。

第2天：取出病毒并冰浴融化，按照预实验得到的MOI值稀释病毒液，并轻轻混匀。

第3天：吸去原有培养基，将MOI稀释好的病毒液加入细胞中，感染16-24小时后更换为新鲜培养基。

第4-5天：继续培养48-72小时，并根据需要收集细胞以检测目标蛋白的表达。

5. 稳转株的构建

成功感染细胞后，可通过抗生素筛选获得稳定表达目的基因的细胞株。例如，针对带有Puromycin抗性的病毒，在感染48-72小时后，将细胞持续于含有适量Puromycin的培养液中进行筛选。待未感染细胞被抗生素清除后，可进行多克隆及单克隆稳转株的筛选。

在以上步骤中，尊龙凯时将继续为您提供详细的操作指南，从而帮助您在细胞病理学及基因治疗研究中取得更进一步的成果。